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              啤酒糟固態發酵產β—葡萄糖苷酶的研究
              來源:  2015-12-21 10:53 作者:

                   啤酒糟是啤酒工業中的主要副產物,是以大麥為原料,經發酵提取籽實中可溶性碳水化合物后的殘渣。在國內,啤酒糟主要作為飼料被直接使用,利用效率很低。啤酒糟中含有豐富的蛋白質、脂肪、膳食纖維,氨基酸、糖類和多種微量元素,是良好的天然培養基,不僅可以發酵生產一些蛋白飼料,同時也可以用于工業酶制劑的生產。啤酒糟的再利用,可以增加啤酒工業的附加值,降低其生產成本。


                 文章來源華夏酒報;  β—葡萄糖苷酶又稱β—D—葡萄糖苷葡萄糖水解酶,它可以水解糖鏈末端非還原性的β—D—葡萄糖苷鍵。β—葡萄糖苷酶是纖維素酶的主要組成成分,直接影響著纖維素酶的降解能力。


                此外,β—葡萄糖苷酶在食品行業中也有著廣泛的應用,如作為水果和茶葉的風味酶,水解大豆異黃酮甙元等。β—葡萄糖苷酶存在于自然界很多植物中,也存在于酵母、曲霉屬、木霉屬及一些細菌中。黑曲霉是公認安全的微生物之一, 在纖維物質的誘導下,黑曲霉可產生胞外β—葡萄糖苷酶。


                筆者研究了黑曲霉固態發酵啤酒糟產β—葡萄糖苷酶的工藝條件,同時探討了β—葡萄糖苷酶合成的動力學機制,望能為啤酒糟的再利用提供一定數據依據。


                   1 材料和方法
                   1.1 菌種
                   黑曲霉購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。
                   1.2 試劑和設備
                   1.2.1 主要試劑
                   啤酒糟由蚌埠學院生物與食品工程系啤酒發酵實驗室提供;
                   水楊苷(進口分裝)、微晶纖維素(進口分裝)、羧甲基纖維素鈉(CMC)、 3, 5—二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚。
                   1.2.2 主要設備
                   752分光光度儀(上海菁華科技儀器有限公司)、DH Z—D冷凍恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)、SFAT—8000固態發酵罐(常州新區三環生物工程成套設備有限公司)。


                   1.3 培養基
                   斜面培養基:PDA培養基;
                   發酵培養基:啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中,用基本培養液調初始含水量,121℃滅菌20min。


                   1.4 試驗方法
                   1.4.1 粗酶液的制備
                   黑曲霉在無菌條件下接入斜面培養基,30℃培養72h。每100ml  無菌水接入1環孢子配置種子懸浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比將種子懸浮液接入滅菌后的發酵培養基中,培養96h。用100ml去離子水浸提培養基,攪拌1h,抽濾,在3000r/min條件下離心15min,收集上清液,即為粗酶液。
                   1.4.2 單因素分析
                   在其他條件不變的情況下,分別測定不同溫度、料液比和接種量對β—葡萄糖苷酶酶活的影響。
                   1.4.3 正交分析
                   利用L9( 34 )正交試驗優化β—葡萄糖苷酶的發酵條件。
                   1.4.4 動力學研究
                   發酵過程中,每隔24h分別測定發酵培養基中Cx 酶、β—葡萄糖苷酶和C1酶的活性,分析β—葡萄糖苷酶酶活隨時間的變化情況。


                   1.5 酶活力的測定
                   1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的測定。取4支洗凈烘干的10ml具塞刻度試管, 編號后各加入1.5ml0.5%水楊酸苷檸檬酸緩沖液,向1號試管中加入1.5mlDNS溶液以鈍化酶活性,作為空白對照,比色時調零用。將4支試管同時在50℃水浴中預熱5min—10min,再各加入酶液0.5ml,50℃水浴中保溫30min,取出后立即分別向2、3 和4號試管中加入1.5ml DNS 溶液以終止酶反應,充分搖勻后沸水浴5min,取出冷卻后用蒸餾水定容至10ml,充分混勻。
                   以1號試管溶液為空白對照調零點,測定2、3和4號試管液的吸光度值并記錄結果。定義在測定條件下,1min內水解水楊酸苷生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。


                   1.5.2 葡萄糖內切酶(CX)活力的測定 以羧甲基纖維素鈉為底物,方法同上。
                   1.5.3 葡萄糖外切酶(C1)活力的測定 以微晶纖維素為底物,方法同上。
                   1.5.4 還原糖的測定 采用DNS(3,5—二硝基水楊酸)法。


                   2 結果與分析


                   2.1單因素分析
                   溫度是黑曲霉生長的重要條件之一,它不僅影響著菌體的生長速率,同時也制約著代謝產物的水平。在30℃條件下,β—葡萄糖苷酶的活力最高,而40℃時酶活最低。值得注意的是,從培養基孢子生長情況上看,25℃條件下,黑曲霉產生的孢子稀疏,主要以菌絲體為主;而在37℃條件下,孢子生長的十分密集,但兩者β—葡萄糖苷酶的酶活相差不是很大。


                   這一現象表明,兩種產酶機制的不同,25℃更適合β—葡萄糖苷酶的生成,而37℃時,雖然產酶水平不高,但孢子數量巨大,產生的總酶活也高。
                   在固態發酵中,初始含水量主要影響著菌體對氧氣的攝取。按料液比(培養基:水,g/ml)1:5配置培養基的初始含水量時酶活最高。當含水量過高時,由于限制了培養基對氧的攝取,產酶水平開始下降。


                   在一定范圍內,隨著接種量的增大,酶活逐漸變大,當接種量增大到10%以上后,酶活變化減小,這可能是由于菌種數量過大,導致培養基營養成分的迅速消耗,從而影響酶的產量(見表2)。


                   2.2正交試驗優化發酵工藝
                   利用正交表設計L9( 34 )正交試驗, 溫度的三個水平分別為25℃、30℃和37℃;含水量分別為1:1、1:3 和1:5;接種量為2%、5%和10%(見表1)。


                   可以看出, 在25℃、含水量1:5和接種量10%的條件下, 酶活達到10.85U / g;其中含水量對β—葡萄糖苷酶酶活具有顯著的線型相關( p< 0.05)。


                2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
                   葡萄糖苷酶是纖維素酶的重要組成成分,在很大程度上決定著纖維素酶的活性。以啤酒糟為培養基,在30℃,接種量10%和料液比1:5的條件下,利用固態發酵罐進行發酵,每隔24h測定黑曲霉產β—葡萄糖苷酶, 繪制各種酶的酶活變化曲線。


                   Cx酶在72h時達到產酶的高峰期,而β—葡萄糖苷酶的酶活則繼續增大。在96h后,β—葡萄糖苷酶酶活的增幅變小,這一現象可能說明,在96h時該酶已經進入產酶的高峰期;此后,由于菌絲體發生自溶,胞內的β—葡萄糖苷酶釋放到培養基中,使酶活進一步變大。利用啤酒糟作為培養基,β— 葡萄糖苷酶的酶活要遠高于Cx酶,而用其它培養基時,Cx酶的酶活要高于β—葡萄糖苷酶,這表明啤酒糟適合于β—葡萄糖苷酶的發酵生產。

               


                   3 結論


                   目前,β—葡萄糖苷酶主要是利用微生物發酵進行生產,尤其是黑曲霉和米曲霉,培養基多為麩皮、蛋白胨和各種無機鹽。


                有研究表明,初始pH值對于β—葡萄糖苷酶的產量有著重要的影響。


                   啤酒糟富含各種營養成分,有利于誘導β—葡萄糖苷酶的產生,可能成為該酶發酵生產的天然培養基。實驗表明,在25℃,料液比1:5和接種量10%的固態發酵條件下,酶活可達到10.85U / g;動力學研究顯示,β—葡萄糖苷酶在96h進入產酶高峰期,120h時達到酶活最高值。此外,發酵后的啤酒糟由于纖維結構被破壞,從而更容易被動物吸收,可能成為較好的有機飼料。


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              編輯:苗倩
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